دانشجویان میکروبیولوژی دانشگاه مراغه

کشت وتکثیر باکتریها در محیط های مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتر ی شناسی است . برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی- حرارت-رطوبت کافی- نمک- PH مناسب- حضور یاعدم حضوراکسیژن می باشد. محيط های كشت را متناسب با نوع آزمايش مي‏توان به دو صورت مايع و جامد تهيه كرد.                  

۱- محيط كشت مايع :

 محيط های مايع به علت نداشتن آگار در تركيب خود به صورت جامد در نيامده و متناسب با نوع ميكروارگانيسم و آزمايشهاي مورد نظر مي‏توان آنها را در لوله‏هاي آزمايش ـ ارلن ماير و يا ظروف ديگر مورد استفاده قرار داد.

 ۲.محیط كشت جامد :                

 محيط های جامد  به علت دارا بودن آگاردر تركيب خود به صورت جامد بوده و متناسب با ميكروارگانيسم ها و آزمايش هاي مورد نظر مي‏توان آنها را در لوله - ظروف پتري(پلیت)و يا ظروف ديگر مورد استفاده قرار داد . البته محیط های نیمه جامد نیز وجود دارد.که میزان آگار آن نسبت به محیط های جامد کمتر است.مثل SIM

 كشت هاي جامد در لوله را مي‏توان به صورتهاي زير تهيه كرد :

۱. کشت هاي عمقي Stab Cultures :

حدود 5 الي 10 ميلي ليتر از محيط كشت را در لوله آزمايش ريخته و به طور عمودي مي‏گذارند تا محيط بسته شود. سپس ميكروارگانيسمها را توسط سوزن كشت(آنس) به طور عمقي در مركزاين محيط كشت مي‏دهند . 

۲.كشت در داخل محيط جامد Shake Cultures:

به لوله‏هاي آزمايش محتوي محيط كشت جامد پس از ذوب شدن كه تا 45 درجه سلسيوس سرد شده است. باكتري مورد نظر را افزوده و لوله را بين دستها تكان مي‏دهندتا باكتريها كاملا با محيط كشت مخلوط شوند , سپس لوله آزمايش را به طور عمودي قرار مي‏دهند تا محيط بسته شود . 

۳.  كشت شيب دار Slant  Cultures:

حدود 5 ميلي ليتر از محيط كشت جامد (ذوب شده) در لوله آزمايش و يا لوله‏هاي كوچك ديگر ريخته مي‏شود و پس از سترون كردن آنها را به صورت كج به گونه‏اي مي‏خوابانند كه سطح محيط كشت شيب دار باشد . 

 ميكروارگانيسمها را با سوزن كشت(آنس) در عمق و سطح و يا به وسيله فیلدوپلاتین نوك  حلقه‏اي ( لوپ ) در سطح شيب دار كشت مي‏دهند.

كشت جامد در پلیت به سه صورت انجام مي‏گيرد :

۱.كشت خطي در سطح محيط هاي جامد در ظرف پتري:

با اين روش مي‏توان ميكروارگانيسم را بطور خطي توسط فیلدوپلاتین نوك حلقه‏اي (لوپ) در سطح محيط جامد كشت داد.

۲.  كشت در سطح محيط :

 در اين روش توسط پي پت مقداری از رقت معيني از ميكروارگانيسم را در سطح محيط جامد ريخته و با ميله پخش كننده , كاملا در سطح محيط مي‏گسترانند . 

۳.  كشت هاي دو لايه :

در اين روش كشت مايع باكتري (سوسپانسيون باكتري) به محيط كشت ذوب شده (حرارت 45 درجه سلسيوس ) افزوده مي‏شود. در صورت لزوم باكتري را با لايه نازكي از همان محيط كشت مي‏پوشانند و پس از بسته شدن محيط ظرفهاي پتري را به طور واژگون در گرمخانه قرار مي‏دهند تا از ريختن قطرات آب درسطح محيط جلوگيري گردد . 

انواع محيط هاي كشت:

محيط هاي كشت را از نظر تركيب شيميايي و دارا بودن مواد غذائي يا مواد باز دارنده مي‏توان به چند دسته تقسيم كرد . 

 ۱. محيط كشت انتخابي (Selective) :

 اين محيط ها براي جدا كردن يك يا دسته‏اي از ميكروارگانيسم‏ها بكار مي‏روند و به علت دارا بودن مواد بازدارنده، از رشد ميكروارگانيسم‏هاي ناخواسته جلوگيري مي‏كنند مانند محيط  برد باركر جهت جدا كردن استافيلوكوكوس اورئوس و يا محيط S.S براي سالمونلا و شيگلا و يا محيط داراي نمک هاي صفراوي براي جدا كردن كلي فرمها .

2.محيط هاي كشت غني كننده (Enrichment) :

 اين محيط ها معمولا در مواردي به كار مي‏روند كه تعداد ميكروارگانيسم مورد جستجو   درنمونه غذائي كم بوده و يا به علت وجود زياد ميكروارگانيسم‏هاي ديگر جدا كردن آن با اشكال مواجه باشد.اين محيط ها با تركيب خاص خود از نظر pH و مواد غذائي امكان رشد براي ميكروارگانيسم مورد نظر را فراهم مي‏كند،مانند محيط گوشت پخته براي جدا كردن استافيلوكوكوس اورئوس . 

۳.محيط هاي كشت افتراقي (Differential) :

 محيط هايي هستند كه ميكروارگانيسم‏هاي مختلف در آن ويژگيهاي خاص خود را نشان مي‏دهند , مانند محيط هاي خون دار كه در آن نمونه‏هاي هموليتيك و غير هموليتيك از هم جدا مي‏شوند .و محيط مك كانكي آگار كه در آن كلي فرمهاي تخمير كننده لاكتوز پرگنه‏هاي قرمز مي‏دهند . در حالي كه باكتريهاي روده‏اي كه قادر به تخمير لاكتوز نيستند مانند سالمونلا پرگنه‏هاي بي رنگ به وجود مي‏آورند . 

 

          معرفی برخی از محیط های کشت مورد استفاده:

1. Blood agar

محیط کشت آگار خوندار یکی از محیط های کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتری ها راتامین می کند

وهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگار پایه لازم است محیط چهل تا پنجاه درجه سانتیگراد خنک شود. دراین مرحله پنج میلی لیتر خون تازه به ازای هرصد میلی لیتر محیط افزوده وپس از مخلوط کردن درپلیت های استریل تقسیم کنید.در این محیط برخی دارای همولیز آلفا(ناقص)و برخی بتا(کامل) و برخی گاما(فاقد همولیز)میباشند .نوع همولیز استاف اورئوس بتا میباشد یعنی همولیز کامل.این محیط محیط مناسبی برای هموفیلوس ها نیز می باشد.

2. E.M.B

ائوزين متيلن بلو آگار نوعي محيط کشتی است كه براي تشخيص و جداسازي باكتري هاي ميله اي روده اي گرم منفي استفاده مي شود. همچنين ائوزين متيلن بلو آگار مانع از رشد باكتري هاي گرم مثبت مي شود.ولی برخی گرم مثبت ها مانند استافیلوکوک های گواگولاز مثبت و برخی مخمر ها (کاندیدا آلبیکنس) می توانند در این محیط رشد کنند. مبناي افتراق در اين محيط بكارگيري دو رنگ شاخص يعني ائوزين و متيلن بلواست كه متمايزكننده تخميركننده هاي لاكتوز ازارگانيسمهاي فاقد توانايي تخمير لاكتوز مي باشد. در اين محيط باكتري هاي تخمير كننده لاكتوز داراي كلني هايي قرمز پر رنگ و ارغوانی تا بنفش خواهند

بود در حاليكه ارگانيسم هايي كه نمي توانند لاكتوز را تخميركنند كلني هاي كاملا بي رنگ یا هم رنگ محیط  خواهند داشت.E.coliدر این محیط جلای سبز فلزی خواهد داشت

3.Hekton  Enteric agar

هكتون انتريك آگار محيطي انتخابي براي جداسازي و ترميم نمونه هاي مدفوعي متعلق به باكتري هاي روده اي به ويژه سالمونلا و شيگلا است. اين محيط  باكتري هاي تخميركننده لاكتوز را از آنهايي كه نمي توانند از تخمير لاكتوز ، اسيد توليد كنند با ايجاد رنگ زرد - نارنجي روي محيط مناسب در حضور شاخص pH متمايز مي كند . باكتري هايي كه لاكتوز راتخمير نمي كنند، روي محيط تغيير رنگ ایجاد نمي دهند. هكتون انتريك آگارمي تواند توليد گاز هيدروژن سولفيد را با تيره نمودن بخش هايي از محيط  نشان دهد.

 4. Mackonkey agar

مك كانكي آگار محیطی جامد براي متمايز كردن جمعيت زيادي ازميكروبها است.اين محيط اهميت كاربردي زيادي در شناسايي تخميركننده هاي لاكتوز، پاتوژن هاي روده اي گرم منفي دارد.این محیط شامل پپتون, بافر,لاکتوز,کریستال ویوله,املاح صفرابی و معرف نوترال رد است که مانع رشد باكتريهاي گرم مثبت می شود. كلني باكتري هاي تخميركننده لاكتوز،محيط را به رنگ قرمز درمي آورند.رنگ قرمز درنتيجه ايجاد محيط اسيدي بوسيله تخمير كننده هاي لاكتوز شكل مي گيرد.ارگانيسم هايي كه نمي توانند لاكتوز را تخمير كنند، سبب تغيير رنگ نمي شوند.در واقع همرنگ با محیط می شوند.

5.Mannitol salt agar

يك  محيط انتخابی براي تمايز استافيلوكوكهاي پاتوژن مانيتول سالت آگار است. غلظت بالاي نمك(7.5%) در اين محيط مانع از رشد بيشتر ميكروارگانيسمها مي شود.نه تنهااستافيلوكوك هاي پاتوژن مي توانند در اين محيط رشد كنند بلكه آنها در اين محيط اسيد هم توليد مي كنند.اين اسيد توليد شده به عنوان شاخصpH موجب تغيير رنگ محيط از قرمز به زرد مي شود. استافيلوكوك هاي غير باتوژن نيز قادر به رشد در اين محيط هستند ولي نمي توانند اسيد توليد كرده رنگ آن را تغيير دهند.

6. Mueller Hinton agar  

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطر و اتوکلاو نمودن , محیط را در پلیت های استریل تقسیم نمایید.

7.S I M Medium  

 محیطی نیمه جامد که از این محیط برای بررسی حرکت باکتری, توانایی احیای گوگرد و تولید SH2 ,تست اندول استفاده می شود.

.Salmonella shigelle agar ….SS agar.8

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت و بسیاری از باکتریهای گرم منفی جلوگیری می کند و به عنوان یک محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا و شیگلا بخصوص از نمونه مدفوع بسیار مناسب است.این محیط حاوی عصاره گوشت ,لاکتوز ,پپتون ,املاح صفراوی ,برلیانت گرین ,سیترات ,آگار ,تلوریت سدیم یا پتاسیم, و معرف نوترال رد است.

9. TSI.......Triple sugar iron agar

این محیط حاوی سه قند گلوگز و لاکتوز و سوکروز است با این تفاوت که میزان گلوگز آن 1%میزان دو قند دیگر است.علاوه بر این قند ها این محیط حاوی پپتون ,تیو سولفات,آهن,آگار,بافر و معرف فنل رد است.روش کشت در این محیط به صورت عمقی و خطی است. و از این محیط برای نشان دادن تخمیر قند ها و تولید CO2,H2S استفاده می شودو نتایج در دو بخش سطح و عمق لوله مورد بررسی قرار می گیرد.و به صورت اسیدی و قلیایی گزارش می شود.باکتری از قند استفاده کرده باشد تمام لوله اسیدی و به رنگ زرد دیده می شود و درغیر این صورت تمام لوله قلیا یی و قرمز خواهد بود.اسیدی شدن را با حرف A و قلیایی شدن را با Alk نشان می دهیم.

A/A:تمام لوله زرد است و باکتری تمام قند را مصرف کرده و سبب اسیدی شدن محیط شده است.

Alk/A:این حالت در طی 72 ساعت نشان دهنده مصرف تنها گلوگز است و بقیه قند ها مصرف نشده اند.

Alk/Alk :هیچ قندی مصرف نشده و محیط تغییر رنگ نمی دهد و شرایط قلیایی است.

اگر باکتری در این محیط قادر به استفاده از تیو سولفات سدیم باشد H2S  تولید می کندکه با املاح آهن موجود در محیط رسوب سیاه رنگ خواهد داد. همچنین اگر تخمیر قندبا تولید CO2 همراه باشد,حباب و ترک خوردن و حتی جابجایی محیط را خواهیم داشت.

10.Lysine iron agar  

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در دکربوکسیلاسیون و دآمیناسیون لیزین استفاده می شود.محیط مزبور را پس از تهیه در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود.

11. Kligleriron agar 

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در تخمیرقند گلوکز و لاکتوز استفاده می شود . پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود .

12. Dnase test agar

در این محیط  فعالیت آنزیم  دزوکسی ریبو نوکلئاز بررسی می شود.این آنزیم به پیوند های DNA حمله می کند این آنزیم یک آنزیم خارج سلولی است که مقاوم به حرارت بوده و برای شناسایی برخی باکتری ها مثل استاف اوروئوس می توان از این محیط استفاده کرد.

13. Endo agar

محیط جامدی است برای جدا سازی کلی فرم ها و سایر باسیل های روده از آب و غذا و سایر نمونه های کلینیکی.

14.  Bile Esculine agar

این محیط به علت دارا بودن اسکولین وصفرا برای شناسایی انتروکوک ازسایر استرپتوکوکها بسیار مناسب است. دراین محیط صفرا به برخی از استرپتوکوکها ازجمله انتروکوک اجازه رشد می دهد وباعث لیز بسیاری از استرپتوکوکها می شود و در صورتی که باکتری قادر به هیدولیز اسکولین باشد گلوکز و اسکولتین(یک مولکول الکلی می باشد)آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجاد کمپلکس سیاه رنگ می شود.

15.MR VP

محیط مایع و حاوی گلوگز است .حال اگر باکتری قادر باشد گلوگز را از راه Mixed acid تجزیه کند اسید حاصله با PH:4-4.5 با معرف متیل رد به رنگ قرمز در می آید.ولی اگر باکتری گلوگز را از راه بوتان دیول تجزیه کند و محصول آن تر کیب حد واسطی مانند استوئین باشد که PH:6-6.5 دارد به معرف متیل رد جواب نمی دهد ولی با محلول پتاس 40% و آلفا نفتول کمپلکس قرمز رنگی ایجاد می کند.

محیط کشت آگار خوندار Blood agar

محیط کشت عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتریهای بیماریزا بخصوص باکتریهایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود.بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتریها را نیز می توان کاوش کرد.

پس از اتوکلاو محیط پایه هنگامی که درجه آن تا حدود 50 درجه سانتیگرا د رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت 5 تا 7 درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیتهای استریل می ریزیم.

ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد.

1-همولیز کاملβ:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده واطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد میگردد.                                                        

2- همولیز ناقصα:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از 50 درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.

 3-عدم همولیزγ :باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد

محیط کشت آگار شکلاته Chocolate agar   

اگر به محیط پایه آگار خوندار هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو درحدود 80-70 درجه سانتیگراد باشد ، خون دفیبرینه گاو اضافه کنیم ، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید. 

در این محیط بعلت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته ، برای رشد باکتریهایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی  آماده دارند مناسب می باشد.

همانند محیط کشت آگار خوندار Blood agar بسته به نوع باکتری همولیز ویا همولیز ناقص وعدم همولیز ایجاد میگردد.                              

محیط کشت بریلیانت گرین آگار Briliant green agar

محیطی است انتخابی و برای جداسازی گونه های سالمونلا بکار می رود. این محیط از رشد بسیاری از باکتریها ی روده ای (انتروباکتریاسه)  به جز سالمونلا جلوگیری می نماید. در صورتی که Ecoli ،کلبسیلا و پروتئوس و سایر انترو باکتریاسه ها  رشد نمایند ، به دلیل اینکه قند لاکتوز ویا سوکروز ویا هر دو را تخمیر می نمایند و تولید اسید می کنند، در مجاورت معرف رنگی فنل رد به رنگ زرد در می آیند .در صورتی که باکتری های لاکتوز منفی مانند سالمونلا رشد نمایند ، به دلیل عدم تخمیر قند در مجاورت معرف ، محیط به رنگ ارغوانی در می آید.                                                     

محیط  کشت مک کانکی آگار Macconkey agar  

محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتریهای گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتریهای گرم مثبت می شوند. باکتریهای تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبتها) کلنیهایی به رنگ ارغوانی و باکتریهاییی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفیها )کلنیهایی بی رنگ ایجاد می نمایند.

رنگ ارغوانی کلنیهای باکتریهای لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است.

معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است.

محیط کشت سابور دکستروز آگار  Saborad Dextrose agar

 محیط انتخابی برای تکثیر قارچها می باشد،که بسیاری از باکتریها نیز در این محیط رشد می کنند . انتخابی بودن این محیط برای قارچها بر اساس PH پایین و همچنین مواد غذایی ناچیز آن است .

محیط  کشت  DNASE 

باکتریهایی که حاوی آنزیم دی اکسی رایبو نوکلئاز باشند ، هاله صورتی رنگی اطراف کلنیها پدید می آورند. تولوئیدن آبی در حضور  DNA سالم به رنگ آبی است. ولی در صورت ریختن  HCL ی نرمال موجب تخریب مولکول DNA شده و این ترکیب به رنگ صورتی در می آید.

محیط کشت مولر هینتون آگار   Mueller hinton agar

کاربرد اصلی این محیط جهت تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی باکتریها ( آنتی بیوگرام ) به روش دیسک می باشد .بسیاری از باکتریها یی که سخت رشد  Fastisious می باشند نظیر  Neisseria meningitides  N.gonorrhoeae  در آن رشد می یابند.                                                

محیط  کشت فلچر       Fleche’s  medium

این محیط برای جداسازی و نگهداری لپتوسپیراها بکار می رود. پس از استریلیزه کردن و خنک نمودن محیط ، به آن 80 میلی لیتر سرم خرگوش استریل اضافه نموده ، سپس به مقدار 7-5 میلی لیتر در لوله های استریل ریخته به مدت 30 دقیقه در حرارت 56 درجه سانتیگراد قرار می دهیم، تا عامل مکمل موجود در سرم غیر فعال گردد.

برای جداسازی لپتوسپیرا، نمونه های خون-ادرار و نسج مشکوک رادر این محیط کشت داده ودر حرارت 29درجه سانتیگراد به مدت 30 روز انکوبه می نماییم. متناوبا از کشت گسترش تهیه کرده وبوسیله میکروسکوپ با زمینه تاریک کشت را کنترل می نماییم.

در اثر تکثیر لپتوسپراها کدورت جزئی در محیط به وجود می آورند که پیدایش یک حلقه شیری رنگ در قسمت بالای محیط می تواند حاکی از رشد لپتوسپرا باشد.

محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth (MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرمها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن  از این محیط استفاده می شود.

آزمایش  MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت ، مقدار 6/0 میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.                                                                         

                                                                                                                                                    

نتیجه: ظهور رنگ قرمز---------آزمایش مثبت  (PH=4/4)

        ظهور رنگ نارنجی-------آزمایش مثبت ضعیف(PH=5/3)

        ظهور رنگ زرد ---------آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف :MR

1-متیل رد    --------  04/0 گرم

2-اتانول      -------- 40 میلی لیتر

3-|آب مقطر --------  100 میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم 100 میلی لیتر می رسانیم .

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود6/0 میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار 2/0 میلی لیتر محلول پتاس (معرف B)  اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی  تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت ،واگر تغییر رنگی صورت نپذیرد ، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه: مثبت=  ظهور رنگ صورتی تا قرمز

        منفی=  تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A :

1-آلفانفتول  -------------  5 گرم

2-الکل اتلیک مطلق-------  100 میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه(نی) شود در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B :                                                                             

1-هیدروکسید پتاسیم -----  40 گرم

2-آب مقطر  ------------  100 میلی لیتر

محیط کشت سلنیت  F براث  Selenite  F  broth

محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها .که یک محیط غنی کننده  Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی میگردد.میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی 24-12 ساعت اول از رشد هر یک از باکتریهای روده ای سریعتر است .بنابر این کشت ثانوی باکتری  در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (24-12 ساعت) انجام گردد. 

باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید. بنابر این هرچه کم رنگتر باشد ، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.

محیط کشت  SIM    ((Sulfide-Indol-Motility

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab  تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز  در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است.قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و درصورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است ،انتشار می یابد .سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد.با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس  Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت 24 ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است .باکتریهای که حاوی مجموعه آنزیمهایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند ،باشند قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد.باکتریهای فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است،کدر می کنند.برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول :                                     

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید    ------------------   5 گرم

ایزو آمیل الکل                      -------------------  75 میلی لیتر

اسید کلریدریک                   -------------------  25 میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده واز بنماری 55-50 درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در 4 درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم .رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوهای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

محیط آبگوشت حاوی 5/6 درصد نمک  6.5%  Nacl broth))

استرپتوکوکهای روده ای را که غلظت زیاد نمک را تحمل می کنند، می توان به کمک این محیط از سایر استرپتوکوکها تشخیص داد.

تفسیر آزمایش:از آنجا که تمام استرپتوکوکها از تخمیر گلوکز اسید تولید می کنند در صورتی که این غلظت نمک را تحمل کنند و در این محیط رشد و تکثیر نمایند ،از تخمیر گلوکز اسید تولید و محیط را به رنگ زرد در می آورند عدم تغییر رنگ دلیل بر عدم تحمل نمک و عدم تکثیر باکتری است.

نتیجه:ظهور رنگ زرد   ----- مثبت

       بدون تغییر رنگ------- منفی      

محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز Lysine decarboxylase broth

این محیط توان باکتری را در دکربوکسیله نمودن اسید آمینه لیزین ،تعیین می نماید. حاصل این واکنش تولید آلکالین آمین و کادوارین می باشد. به عنوان محیط تفریقی در تمایز بین آنتروباکتریاسه ها به کار برده می شود.

تفسیر آزمایش:از آنجا که همه آنتروباکتریاسه ها در نتیجه تخمیر قند گلوکز ،اسید تولید نموده و محیط را به رنگ زرد  در می آورند ،محیط به رنگ زرد باقی خواهد ماند ،مگر آنکه باکتری اسید آمینه مورد نظر را نیز دکربوکسیله کند. در این صورت قلیائیت حاصله، محیط به رنگ  بنفش (قلیایی) در خواهد آمد.

نتیجه:رنگ بنفش -------- مثبت

     رنگ زرد --------- منفی

 محیط کشت گزیلوز لیزین دزوکسی کولات  آگار (XLD)  Xylose-lysin-decarboxycholate-agar

محیطی است انتخابی که از آن  برای جدا سازی گونه های Shigella و سایر باکتریهای پاتوژن روده ای بکار می رود.

کلی فرم ها و دیگر باکتریها یی که قادر به تخمیر یک یا هر دو قند موجود در محیط باشند، کلنی هایی به رنگ زرد پدید می آورند.(اسید) تخمیر کننده های گزیلوز که لاکتوز و سوکروز منفی هستند مانند Proteus mirabilis واکنش اسیدی خفیفی (نارنجی-کهربایی) ایجاد می کنند .گونه ها Shigella که عموما هیچیک از این قندها را تخمیر نمی کنند،سرتاسر محیط لوله را به حالت قلیایی (قرمز-تیره) در می آورند.

گونه های Salmonella اگر چه معمولا گزیلوز مثبت هستند،ولی به واسطه برتری داشتن دکربوکسیلاسیون لیزین بر اسیدیته تخمیر گزیلوز ،محیط کاملا به رنگ قرمز (قلیایی)در می آید.کلنی های همه باکتری هایی که H2S تولید می کنند،بدون توجه به اسیدیته ، مرکزی سیاه دارند. 

                                                                                                            .                               

محیط کشت برد پارکرآگار Baird parker agar    

یک محیط ( Medium) انتخابی است که حاوی تلوریت پتاسیم و تلوریت لیتیم می باشد. تلوریت محیط از رشد کلی فرم ها ممانعت می نماید. استافیلوکوک اورئوس میتواند تلوریت را به تلورید تبدیل نموده و باعث ایجاد کلنی های سیاه بر روی محیط گردد. زرده ی اضافه شده به محیط نیز باعث ایجاد دو واکنش در محیط می گردد. یکی تولید لسیتینازمنجر به ناحیه کدر ودیگری تولید لیپاز که منجر به ناحیه شفاف در اطراف ناحیه کدر می شود. در انتها کلنی های مشکوک به  استافیلوکوک اورئوس باید تست کواگولاز انجام گردد.      

                                                                                                       

محیط کشت اسکولین براث  Esculin broth

محیط کشت تفریقی است که در تعیین هویت عده ای از باکتری ها مانند انترو باکتریاسه،اکتینوباسیلوسها، از آن استفاده می شود.

بعضی از باکتری ها قادرند اسکولین را که نوعی گلیکوزید می باشد هیدرولیز کرده و آنرا به گلوکز،آگلایکن وآسکولتین تبدیل نمایند. در این فرایند آهن موجود در محیط واکنش نشان داده و ترکیبی به رنگ قهوه ای مایل به سیاه ایجاد می نماید.بنابراین تغییر رنگ محیط از زرد شفاف به سیاه ویا قهوه ای به معنی مثبت بودن آزمایش آسکولین می باشد.            

                                                                                          

                                                      

محیط کشت آبگوشت نیترات  Nitrate broth

از این محیط می توان در تعیین توان باکتری در احیای نیترات و تبدیل ان به نیتریت و مواد احیا شده دیگر بکار برد. بسیاری از باکتری ها را می توان از این جهت مورد آزمایش قرار داد، از جمله کورینه باکتریها ، باسیلوسها و اکتینومایستهاو...

پس از کشت باید به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه نموده و پس از آن از هر یک از معرفهای ذیل 5 قطره به محیط اضافه نموده به طوریکه متوجه ظهور رنگ قرمز باشیم.

تفسیر ازمایش: رنگ قرمز مربوط به پارا سولفور بنزن  و آزونفتیل آمین می باشد،که نوعی رنگ آزو(Azo dye)است که در نتیجه دیازوتیازاسیون اسید سولفانیلیک به وسیله نیتریت و همچنین در اثر ترکیب نفتیل آمین با اتم انتهایی آزوتیازید ،اسید سولفانیلیک حاصل می گردد. در صورتی که احیای نیترات از حد نیتریت هم گذشته و به مراحل تولید گاز ازت N2 یا آمونیاک3 NH رسیده باشد، به علت عدم وجود نیتریت در محیط با افزودن معرفهای ذیل تغییر رنگی ظاهر نمی شود. در حقیقت نتیجه آزمایش منفی کاذب است.به منظور تمایز منفی کاذب از منفی حقیقی، به محیط (پس از افزودن معرفها و منفی شدن)کمی پودر روی اضافه نموده، در صورتی که نیترات در محیط باقی مانده باشد یعنی باکتری آنرا به نیتریت تبدیل نکرده باشد، پودر روی ،نیترات را به نیتریت احیا و رنگ قرمز ظاهر می گردد. عدم تغییر رنگ در این مرحله حاکی از عدم وجود نیترات در محیط است. و این به آن معنی است که باکتری نیترات را از مرز نیتریت هم بیشتر احیا نموده و به گازهای ازت و آمونیاک تبدیل کرده است.

نتیجه پس از افزودن پودر روی:

1- ظهور رنگ قرمز -------------- نیترات منفی                       

 2-عدم تغییر رنگ  ---------------  نیترات مثب                     .

معرف تست نیتریت     ( Nitrit test reagent)   

محلول (A):

-اسید سولفانیلیک :          8 گرم

-اسید استیک (5نرمال) :  1 قسمت اسید استیک گلاسیال و 5/2 قسمت آب مقطر

محلول (B) :                                                                                                                                        

-دی متیل 1-آلفا-1 نفتال آمین :  5 گرم

-اسید استیک (5نرمال)  :        1000 میلی لیتر

.

محیط کشت آگار انتخابی ویبریو Vibrio selective agar (TCBS agar)

آگار تیو سولفات سیترات بایل ساکارز جهت جداسازی و کشت انتخابی ویبریوها بکار می رود. غلظت بالای تیو سولفات و سیترات و قلیایی قوی این محیط رشد انتروباکتریاسه ها را تا حد زیادی متوقف می سازد. هر باکتری که بتواند در این محیط رشد کند، قادر به متابولیزه کردن ساکارز نمی باشد. فقط چند گونه ساکارز مثبت پروتئوس می توانند رشد نموده و کلنی های زرد مشابه ویبریو تولید نمایند. اندیکاتور مخلوط تیمول بلو-بروموتیمول بلو با تشکیل اسید به رنگ زرد تغییر رنگ می دهد.(حتی با وجودی که درجه قلیائیت آن بالاست)

محیط کشت کمپیلو باکتر سلکتیو آگار      Campylobacter Selective Agar Base

از این محیط جهت جداسازی کمپیلو باکترها استفاده می گردد. در این محیط کشت که سرشار از مواد مغذی ،اتمسفری با دی اکسید کربن کم و سرشار از دی اکسید کربن(Co2) مطمئنا کمپیلوباکتر بخوبی رشد یافته و آنتی بیوتیکهایی که بعنوان مکمل انتخابی کمپیلو باکتر به محیط اضافه می شوند تاحد زیادی رشد فلورای میکروبی را مهار می نماید. محیط انتخابی کمپیلو باکتر مخلوطی از سه آنتی بیوتیک متفاوت لیوفیلیزه می باشد. این مکمل رشد باکتریهای همراه در طول کشت متوقف می سازد. هر ویال شامل 2 میلی گرم وانکو مایسین ،5 میکروگرم پلی میکسین و 1 میلی گرم تریمتو پریم می باشد.

ماده لیوفلیزه را جهت تهیه آگار  انتخابی کمپیلوباکتر به محیط کشت استریل که به دمای 50-40 درجه سانتیگراد رسیده اضافه می کنیم.

محیط کشت SS       Salmonella Shigella agar

یک محیط انتخابی است که جهت تشخیص سالمونلا و شیگلا مورد استفاده قرار می گیرد. این محیط حاوی تیو سولفات سدیم بعنوان منبع گوگرد و آهن فریک بعنوان منبع آهن می باشد. وهمچنین حاوی لاکتوز و معرف نوترال رد می باشد .اگر باکتری تیوسولفات محیط را احیا کند، H2S  تولید نموده که H2S با آهن موجود در محیط تولید پرگنه های سیاه رنگ می نماید . اکثر باکتری های لاکتوز مانند سالمونلا ها H2S مثبت میباشند.                                                                        

                                                                              

محیط کشت  ONPG  (Orthonitro Phenul –β-D-galacto Pyramside)

با این محیط می توان وجود آنزیم بتا گالاکتوزیداز یعنی آنزیمی را که موجب شکستن مولکول لاکتوز می گردد را تعیین می نماید. مهمترین کاربرد این آزمایش تعیین سریع لاکتوز مثبتهای تاخیری در بین خانواده انترویاسه می باشد. باکتریهایی که دارای آنزیم بتا گالاکتوزیدازباشند ،  ONPG  بی رنگ را سریعا شکسته وبه  د-گالاکتوز ارتونیتروفنل زرد رنگ تبدیل می نماید.

اگر باکتری واجد هر دو آنزیم یعنی پرمه آز و بتا گالاکتو زیداز  باشد پس از 24 ساعت لاکتوز مثبت است. اگر باکتری واجد یکی از دو آنزیم فوق باشد . پس از 72 ساعت با تاخیر لاکتوز مثبت است ،واگر هیچ یک از آنزیمها را نداشه باشد ،لاکتوز مثبت است.                                                         

محیط کشت فنیل آلانین د آمیناز Phenylalanine deaminase agar (PD)  

با استفاده از این محیط می توان قدرت باکتری را در تولید فنیل پیروویک اسید از اسید آمینه فنیل آلانین را تعیین .پس از یک شب انکوباسیون محیط چند قطره محلول 10 درصد کلرور آهن را روی قسمت کشت شده محیط (سطح شیبدار محیط) ریخته ،در صورتی که واکنش دی آمیناسیون صورت گرفته باشد.با افزودن معرف ،رنگ سبز ظاهر خواهد شد. این رنگ سبز نتیجه شلاته  Chlate شدن فنیل پیرووات با یون آهن ایجاد یک ترکیب به رنگ سبز می باشد.در صورت پیدایش رنگ سبز تیره  PD مثبت ودر بدون تغییر (زرد رنگ) PD منفی است.

محیط کشت سیمون سیترات  آگار  Simmons Citrate agar

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربندار موجود در محیط میباشد. باکتریهایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است استفاده کنند و در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند.در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط  آزمایش سیترات منفی است. 

                                                               

محیط کشت سه قندی آهن دار ( TSI)    Triple Sugar iron agar

از این محیط جهت تعیین هویت باکتریهای گرم منفی استفاده می شود. همچنین برای تعیین تولید  H2S بکار می رود.این محیط دارای سه قند گلوکز-سوکروز و لاکتوز می باشد مقدار کمتر گلوکز در قیاس با دو قند دیگر تمایز باکتریها را در تخمیر قندهای مختلف ممکن می سازد. آهن موجود در محیط گاز هیدروژن سولفوره ای را که از مواد گوگرد دار تولید می شود را به دام انداخته و مانع از خروج این گاز از محیط می شود .این واکنش به صورت رنگ سیاه که همان سولفور آهن است مشخص می گردد.گازی که در نتیجه تخمیرمواد قندی حاصل می شود به صورت حبابهایی در عمق محیط دیده می شوند،ویا اینکه حجم گاز ممکن است زیاد بوده که در این صورت محیط آگار را به سمت بالای لوله رانده و فضای زیادی را اشغال می سازد.

نتایج تفسیر واکنشهای      :   TSI

1-در صورتی که هر دو قسمت شیب دار  و ته لوله زرد شده و حباب تشکیل گشته ولی سیاه نشده باشد.یعنی گلوکز ،لاکتوز و سوکروز را تخمیر نموده و اسد تولید کرده و همچنین گاز نیز تولید نموده ولی H2S تولید نشده است  acid/acid ، Gaz⁺ ،^- H2S  می باشد.                                               

2- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و گاز تولید و سیاه باشد ،یعنی تنها قند گلوکز تخمیر شده و H2S نیز تولید شده است. Acid Alk/ ، Gaz⁺ ،⁺H2S  می باشد.

3- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و تولید و سیاه  شده  باشد، یعنی اینکه تنها گلوکز را تخمیرنموده و H2S تولید نشده است . Alk/Acid ، Gaz^- ،^- H2S  می باشد. 

 4- در صورتی که ته لوله و شیب لوله هر دو زرد و گاز متغیر باشد و  ته لوله لوله نیز سیاه شده باشد، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و  H2S نیز تولید نکرده است. acid/acid ، Gaz متغیر  ،⁺ H2S  می باشد.

5- در صورتی که سرتاسر لوله ارغوانی و سیاه نشده باشد، یعنی اینکه هیچ یک از قندها را تخمیر ننموده و H2S نیز تولید نکرده است. Alk/Alk ،  Gaz^- ،^- H2S  می باشد       

6- در صورتی که سرتا سر لوله زرد و گاز  و سیاهی در ته لوله متغیر باشد ، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و تنها اسید تولید کرده ، گاز و H2S تولید ننموده است. acid/acid ،  Gaz^- ،^- H2S  می باشد.   

نکته : باید توجه داشت که نتایج کشت  حداکثر طی 24 ساعت پس از کشت قرائت گردد،چه بسا پس از این مدت ممکن است واکنشهای اسیدی قسمت شیبدار  تغییر یافته و قلیایی گردد.قسمتی از این تغییر واکنش اسیدی به قلیایی مربوط به این است که ذخیره کربوهیدرات های موجود در محیط تماما مصرف شده که در این صورت باکتری به مواد پپتون دار محیط رو می آورد و همچنین مقدار ناچیز اسیدی که در اثر تخمیر گلوکز حاصل شده به سرعت در مجاورت هوا (قسمت شیبدار ) اکسید شده و ما حصل قلیایی است.در عمق لوله نیز به سبب فشار کم اکسیژن واکنش اسیدی حاصل از تخمیر قند گلوکز و همچنان اسیدی باقی می ماند.

محیط کشت ژلاتین    Gelatin medium      

این محیط به منظور تعیین فعالیت پروتئولیتیکی باکتریها می باشد.باکتریهای پروتئولیتیک همیشه باکتریها را ذوب می کنند.در صورتی که کشت ژلاتین در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار داده شود،باید قبل از قرائت لوله های حاوی کشت ژلاتین را در دمای یخچال 4 درجه به مدت 15 دقیقه قرار داده ، در صورتی که باکتری آنزیم ژلاتیناز را داشته باشد ،لوله های کشت ژلاتین پس از انکوباسیون در یخچال به صورت مایع خواهند بود. در غیر اینصورت باکتری فاقد آنزیم ژلاتیناز می باشد.

توجه: نقطه ذوب محیط ژلاتین 30-20 درجه سانتی گراد می باشد.

محیط کشت       Oxidative Fermentative    OF

با کشت باکتری در این محیط می توان مشخص نمود که استفاده باکتری از کربوهیدرات از طریق اکسیداسیون یا از طریق تخمیر صورت کرفته است .این محیط را در دو قسمت ،یکی حاوی پارافین و دیگری فاقد پارافین تهیه نموده و از نمونه در هر دو محیط کشت می دهیم.در صورتی که باکتری تنها از طریق اکسیداسیون قند را مورد استفاده قرار دهد،تنها در لوله ی فاقد پارافین قند را مصرف کرده و محیط را اسیدی نموده،که در مجاورت معرف بروموتیمول بلو به رنگ زرد در می آید.رنگ زرد ازبالای لوله شروع می شودکه باکتری از طریق فرمنتاتیو قندها را تخمیر نماید،هر دو لوله ی کشت ( حاوی پارافین و فاقد پارافین ) بر اثر تولید اسید شاهد ظهور رنگ زرد خواهیم بود. از محیط OF می توان در تمایز کوکسی های گرم مثبت بخصوص استافیلوکوک اورئوس استفاده نمود .

تست اکسیداز  Oxidase test : 3-2 قطره معرف اکسیداز (محلول آبی تترامتیل –فسفات-فنیل آلانیل دی هیدروکلراید روی یک کاغذ صافی در یک پلیت قرار داده(قطرات روی کاغذ صافی خشک شوند)و میکروب مورد آزمایش را با یک سیم پلاتینیوم Platinium wire برداشته و آن را روی کاغذ آغشته به معرف اکسیداز گسترانیده و واکنش مثبت در مدت 10 ثانیه بصورت ایجاد رنگ سیاه مایل به صورتی مشاهده می گردد.

آزمایش کواگولاز   Coagulase test

با استفاده از این آزمایش میتوان وجود آنزیم کواگولاز در باکتری استافیلوکوک اورئوس  را مشخص نمود. آنزیم کواگولاز آنزیمی است که باعث لخته شدن پلاسمای سیتراته خرگوش می شود. با توجه به اینکه سیترات ماده ضد انعقاد می باشد ، اما کواگولاز می تواند حتی در حضور ماده ضد انعقاد ، پلاسما را لخته نماید. (فیبرینوژن را به فیبرین تبدیل نماید. ) 

تست کاتالاز   Catalase test

با استفاده از این تست می توان وجود آنزیم کاتالاز را در باکتری مشخص نمود.در صورتی که باکتری واجد آنزیم کاتالاز باشد ،با اضافه کرن آب اکسیژنه به کلنی برداشته شده  باکتری بر روی لام ،واکنش انجام شده به صورت تولید آب و اکسیژن بوده که به صورت حبابهایی نمایان میگردد. در صورتی که باکتری فاقد آنزیم کاتالاز باشد ، بعد از اضافه نمودن آب اکسیژنه ، هیچ گونه تغییری در تولید حباب حاصل از تجزیه آب اکسیژنه به آب و اکسیژن ایجاد نمی گردد،و در نهایت باکتری کاتالاز منفی می باشد

محیط کشت ائوزین متیلن بلو       Eosin methylen-blue lactose sucrose agar       (EMB)

این محیط فاقد املاح صفراوی می باشد ،و بیشتر برای باکتری های گرم منفی رودهای مناسب می باشد. باکتری  Ecoliدر این محیط در حضور ائوزین متیلن بلو ایجاد جلای سبز فلزی می نماید،که کلید تشخیصی باکتری  Ecoli نسبت به سایر باکتری های روده ایی می باشد.

                                                                                             

محیط کشت Cookeedmeet

از این محیط برای کشت به دلیل وجود پارافین بر روی محیط کشت باعث رشد  باکتری های بی هوازی می گردد. این محیط کشت محیط مغذی و غنی برای باکتری های بی هوازی منجمله کلستریدیوم است. این محیط معرف خاصی نداشته، و هدف این است که محیط کشت مناسب برای باکتری های بی هوازی ایجاد نمود.بعد از رشد باکتری برای تفریق باید بر روی محیط های افتراقی با شرایط بی هوازی جهت تشخیص باکتری مورد نظر پرداخت.